在ISHH，整个实验周期是比较长的，实验程序也比较繁杂，而杂交在ISHH整个实验中可被认为是“短兵相接”的一步。杂交前的一切准备工作如增加组织通透性都是为了在杂交这一步骤中核酸探针能进入细胞或组织与其内的靶核苷酸相结合。因此，杂交是ISHH中关键的而且是重要的一个环节。杂交是将杂交液滴于切片组织上，GISH，加盖硅化的盖玻片，防止孵育过程中的高温（50℃左右）导致杂交液的蒸发。为保证杂交所需的湿润环境，可将其放在盛有少量5×SSC或2×SSC（standardsaline citrate，SSC）溶液的硬塑料盒中进行孵育。杂交液的成分和预杂交液基本相同，所不同的是加入了标记的核酸探针和硫酸葡聚糖。
核酸原位杂交可根据其检测物而分为细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据其所用探针及所要检测核酸的不同又可分为DNA-DNA，RNA-DNA，RNA-RNA杂交。但不论哪种杂交都必须经过组织细胞的固定，预杂交，杂交，冲等一系列洗步骤及自显影或酶法显色以显示杂交结果。
我们在这儿介绍的是整胚原位杂交，不同于一般的在载片上对细胞和组织切片进行探针杂交及检测的原位杂交，
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