亚细胞定位原理
利用GFP、RFP等荧光蛋白具有的荧光性质和灵敏性,来示踪细胞内的蛋白。将目标蛋白与荧光蛋白的N端或者C端融合,通过瞬转或稳转,使该融合蛋白在受体材料细胞内表达,目标蛋白会牵引荧光蛋白一起定位到目标细胞器,经过激光共聚焦显微镜激光照射,荧光蛋白会发出荧光,通过观察荧光蛋白在细胞内显示的位置,从而可以确定目标蛋白的亚细胞定位情况,即可对蛋白质进行准确定位。
为什么不先对一个基因做预测,在预测的结果上直接做共定位?
不同的预测网站有不同的计算方法,同一个基因在不同的预测网站也可能得出不同的定位结果。另外所有的结果都应是基于实验得到的,对于不清楚可能定位在哪里的基因,一般推荐先做普通定位,根据普通定位的结果再决定做哪种细胞器的共定位。
为什么有的基因做原生质体转化时荧光蛋白不亮?
不同物种的细胞可能对基因表达有影响,当在一种材料的原生质体中观察不到荧光时,可以考虑换一种受体材料。另外,如果是分泌蛋白,在原生质体中无法观察到荧光,此时可以考虑注射叶片来观察荧光。
拍摄时为什么有明场通道?
(1)显示细胞状态,有活力的原生质体细胞应该是饱满圆润的,变形或破碎的细胞说明此时细胞不是适状态或细胞已。
(2)显示荧光确实是细胞内蛋白表达的,BIFC,而不是细胞碎片及杂质产生的杂光。
亚细胞定位操作步骤
1、通过一些在线网站预测亚细胞定位
2、亚细胞定位载体构建
(1)引物设计:利用引物设计软件,根据pEGP-MCS-N1或pEGP-C1-MCS的酶切位点设计目的基因引物。
(2)载体构建:将PCR产物酶切后插入pEGP-MCS-N1或pEF-C1-MCS,得到表达目的基因与EGP融合蛋白质的真核表达载体。
3、细胞转染
当细胞生长到对数生长期时,接种到共聚焦显微镜的玻璃底培养皿(35mm petri dish,10 mmMicrowell)中,培养过夜。当细胞贴壁率达到30%~50%时,将融合绿色荧光蛋白GFP的重组载体质粒和目标细胞器质粒共转染细胞。37℃孵箱培养24~72h。
4、激光扫描共聚焦显微镜观察
将上述细胞分别在24、36、48、72h的时间点,根据实验需求选择对应激发波长(常用405nm、488nm和561nm),使用共聚焦显微镜观察,采取图像。
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