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低温生物菌种——制备

也称种子制备，是指菌种在一定条件下，经过扩大培养成为具有一定数量和质量的纯生产菌种的制备过程。以作接入发酵罐中扩大菌体量及合成产物之用。种子制备包括孢子制备和菌丝体制备（见图），其中(1)～(4)为孢子制备过程。保存在沙土管或冷冻管中的生产菌种，用无菌手续挑取少许，接入琼脂斜面培养基上，在25℃（或较高温度）下培养5～7天(或较长时间)。所得孢子还需用较大表面积的固体培养基以获得更多孢子，低温生物菌种，对于霉菌类孢子制备，多数采用大米、小米之类的天然培养基。将培养成熟的斜面孢子制成悬浮液，接种到扁瓶固体培养基上，于25～28℃培养14天。将成熟的扁瓶孢子于真空中抽干，使水分降至10%以下，并放入4℃冰箱中备用。一次制得的孢子瓶可在生产上延续使用半年左右。菌孢子的培养基大多是采用麸皮或豌豆浸出液、牛肉膏及无机盐与琼脂制成的。将斜面孢子接入扩大的扁瓶孢子培养基中，于28～37℃培养5～14天。所获得的大量孢子可直接作为种子罐(6)的种子。如果有些生产菌种不产孢子，如产生菌或产孢子不多的，则可采用摇瓶（5）液体培养制得菌丝体，作种子罐的种子。种子罐的目的是使接入有限的孢子或菌丝体迅速发芽、生长、繁殖成大量菌体。其中的培养基组分应是易于被菌体利用的碳源（如葡萄糖）和氮源（如玉米浆等），及无机盐(如磷酸盐)等。作为发酵罐(7)的种子应是生命力旺盛、染色深、菌丝粗壮，无杂菌及异常菌体。接种量一般在10%～20%。

低温生物菌种——菌种分离方法介绍

孢子分离又可分为以下几种方法：

( 1 ）褶上涂抹法：选取新鲜、健壮、未开伞、未裂破的子实体，洗净后用75%酒精表面灭菌2 分钟，连同培养基一起放入接种箱内，经熏蒸消毒12 ～ 24小时，再按无菌操作技术将接种环在子实体菌褶上涂抹，把涂抹后带孢子的接种环在培养基上划线接种，后置于25 ～ 28℃恒温箱内培养，可得纯菌种。

( 2）孢子印采集法：取灭过菌的载玻片、试纸或黑布，置于新鲜、未开伞或未开裂的子体菌褶的下方。经24小时后，便落下孢子，形成印痕（即孢子印）。用接种环或玻璃棒蘸取孢子，接种在平面或斜面培养基上，进行恒温培养，可得纯菌种。

( 3）孢子收集器采集法：孢子收集器由玻璃钟罩、培养皿、三角架、搪瓷盘等组成。钟罩下为一搪瓷盘，直径25 厘米左右，盘内先垫衬4～6层纱布，中央放1 副9 厘米直径的培养皿，大盖口朝下，上放小的，口向上。在上面小的培养皿上放1只铅丝绕成的三角架，再将带孔的玻璃钟罩盖上，顶上罩孔用棉塞塞好，用纱布包好整个孢子收集器，置于高压灭菌锅或蒸笼内灭菌2小时。

孢子收集器灭菌消毒后，放入无菌室或无菌箱内。用小刀割取1 块4～5厘米大小的子实体，插在收集器内的三角架顶上（若无孢子收集器，也可用培养皿代替）。再置于温度24 ～26 ℃下培养24小时，培养皿中便可见到白色粉状物，此即为孢子。此时，可将孢子收集器再移至接种箱内，取出培养皿，盖好，并在培养皿内加入10 ～ 20毫升的无菌水，使孢子散于本中，成为孢子悬浮液。再用无菌打针筒或吸管吸取孢子悬浮液，接种于试管斜面培养基上，每管注2 ～ 3滴。置于24 ～ 26 ℃温度下培养5 ～ 7 天，培养基上便可长出白色菌落。待菌落直径有0 . 5厘米时，选健壮的菌落，再移接于另一试管的斜面培养基上培养。当白色菌丝长满试管时，便得纯菌种。

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实验室的传代保藏过程

1.按说明书要求复溶菌粉，转种于适当的增菌培养基内（G1），复壮后转接至平板上，并于适当温度下培养适当时间，分离出单个纯种菌落，此为第2代（G2）。

2.鉴定完成后，挑取纯菌落制成浓菌悬液用于制备甘油冷冻管，低温生物菌种公司，挑取纯菌落转接斜面作为工作用。此时，保藏为第2代，但工作用则为第三代。

3.将第2代管冷冻保存，将工作用于适当温度下培养适当时间后可用于试验。

4.取一支冷冻保存的G2代转种于平板和斜面培养基上，平板上的制成冷冻保藏管第三代（G3），斜面培养基经适当温度下培养适当时间后用作工作用（W3）。

5.将第三代（G3）冷冻或低温保存，将生长、转种后的G2经灭菌处理后丢弃。

6.当工作用代数小于5时，可直接用上一代工作用转接下一代工作用，低温生物菌种多少钱，如W3可直接转接为W4。

7.按上述程序操作，直至G4转为W5为止，需重新开启安瓿，再重复上述操作程序、保藏和使用。

以上方法中，低温生物菌种生产厂，被分为两类。传代用和工作用，传代用用于甘油冷冻管法保藏，工作用用斜面低温保藏法保藏。

实验证明，甘油冷冻管的有效期至少为2年，但其主要适用于细菌（需氧）、酵母菌的传代、保藏、真菌和芽孢类细菌则需应用其它方法。

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